Morris水迷宮在血管性癡呆大鼠海馬中的影響
1 材料與方法
1. 1 材料
1. 1. 1 實驗動物健康SPF 級Wistar 大鼠80 只，購自南方醫(yī)科大學動物實驗中心，體重200 ～ 250 g，雌雄比例為1∶ 1，所有實驗大鼠飼養(yǎng)于廣州**廣州總醫(yī)院動物中心，飼養(yǎng)房內(nèi)溫度( 22 ± 3) ℃，濕度60%，5 只/籠，光/暗周期為12 h /12 h，實驗期間自由獲取水及標準顆粒飼料。
1. 1. 2 主要試劑兔抗鼠5-HT6司，Envision 二步法檢測試劑盒購自Dako 公司，二氨基聯(lián)苯胺( DAB) 試劑購自福州邁新生物公司，其余化學試劑均為分析純級。
1. 1. 3 主要儀器Morris 大鼠水迷宮，SuperMaze 動物行為學視頻分析系統(tǒng)( 上海欣軟信息科技) ，日本Olympus BX-51 顯微鏡， ImagePro plus 病理圖文分析系統(tǒng)。
1. 2 方法
1. 2. 1 動物分組及模型制作所有大鼠適應性飼養(yǎng)1 w 后隨機分成兩組，VD 組50 只，假手術(shù)組( SO 組) 30 只。動物術(shù)前禁食、禁水4 h，稱重后以10%水合氯醛按350 mg /kg 體重腹腔注射麻醉，將大鼠仰臥位固定后常規(guī)**頸部手術(shù)區(qū)域，在頸前正中作一長約1 cm 的縱形切口，鈍性分離皮下軟組織、頸前肌群，在氣管的側(cè)后方找到頸動脈鞘，分離頸總動脈與迷走神經(jīng)，以1 號絲線長久性結(jié)扎頸總動脈，同法結(jié)扎另一側(cè)頸總動脈，局部**后恢復組織層次并縫合皮膚。SO 組大鼠除不結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈外，其余操作與VD 組大鼠一致。術(shù)后動物另放于干凈鼠籠飼養(yǎng)，自由獲取水源及飼料。
1. 2. 2 動物行為學觀察( Morris 水迷宮實驗) 大鼠Morris 水迷宮為一內(nèi)徑160 cm、高50 cm 的圓形水池，水池內(nèi)壁被漆成黑色，池壁上黏貼不同形狀的空間標記物，一個直徑為12 cm的逃生平臺固定于水池中的某一象限( 即目標象限) ，進水后水面高出平臺約1 cm，水池上方橫架安裝連接計算機顯示系統(tǒng)的攝像儀。
SO 組和VD 組大鼠分別在雙側(cè)頸總動脈阻斷術(shù)后4、8 w進行Morris 水迷宮實驗，第1 ～ 4 天( 即trial 1、trial 2、trial 3、trial4) 將大鼠從四個不同象限面向水池壁放入水中，大鼠找到逃平臺后終止信息采集，*長采集時間為120 s，若超過120 s大鼠仍未能找到平臺，則將其引導至逃生平臺并在平臺上站立20 s 以使其形成對空間參照物的記憶，每只大鼠如此訓練4次/d，每次訓練之間有15 s 間歇以便休息，連續(xù)訓練4 d，記錄大鼠找到平臺的逃避潛伏期評估其空間學習能力; 第5 天將逃生平臺從水池中撤去，將大鼠從四個不同象限投入水中，記錄60 s 內(nèi)大鼠在目標象限搜尋的時間，以此評估大鼠的空間記憶能力。每天固定在8: 00 ～ 17: 00 進行水迷宮實驗，實驗過程中保持房間內(nèi)光照恒定并且無光線直射于水面，水溫控制在26℃左右，迷宮外參照物保持不變。1. 2. 3 組織標本固定、制片、染色每組各取5 ～ 6 只大鼠分別在術(shù)后的相應觀察終點麻醉動物，以4℃預冷4% 多聚甲醛溶液經(jīng)心臟灌注固定，斷頭取腦后從視交叉后2 ～ 3 mm 處冠狀位切取厚度約3 mm 的腦組織，放入10% 中性甲醛溶液中固定24 h。在自動脫水機中梯度酒精脫水、透明、浸蠟后包埋，蠟塊組織作連續(xù)冠狀切片，厚度2 ～ 3 μm。石蠟切片脫蠟、水化后分別進行蘇木素-伊紅( HE) 染色和Nissl 染色，在光學顯微鏡高倍鏡( × 400) 下觀察海馬CA1 區(qū)錐體細胞計數(shù)及形態(tài)。
1. 2. 4 **組化顯色分析海馬CA1 區(qū)5-HT6受體的分布與表達石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化，置于pH6. 0 的檸檬酸鹽中高壓修復; 0. 01 mol /L PBS 沖洗5 min × 3 次，3% 過氧化氫溶液避光孵育10 min 以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，0. 01 mol /L PBS 沖洗5 min × 3 次，切片滴加兔抗鼠5-HT6受體多克隆抗體( 1∶ 1 000
稀釋) ，置于濕盒內(nèi)4℃ 冰箱中過夜孵育; 次晨取出切片0. 01 mol /L PBS 沖洗5 min × 3 次，滴加葡聚糖復合物( 二抗) ，室溫下孵育40 min，0. 01 mol /L PBS 沖洗5 min × 3 次，滴加DAB 顯色，顯微鏡下觀察顯色合適后流水沖洗終止反應，梯度酒精脫水、TO 生物透明劑透明，中性樹膠封片后鏡檢觀察。
1. 3 統(tǒng)計學方法應用SPSS13. 0 軟件進行分析，計量資料采用x ± s 表示，兩組獨立樣本均數(shù)比較采用t 檢驗，多個樣本均數(shù)比較進行Levene 方差齊性檢驗，方差齊采用單向方差分析，方差不齊采用Brown-Forsythe 法; 平均逃避潛伏期和平均游泳速度在滿足Mauchly 球?qū)ΨQ檢驗時采用單個重復測量因素的方差分析，不滿足Mauchly 球?qū)ΨQ檢驗經(jīng)Huynh-Feldt 系數(shù)校正自由度。
2 結(jié)果
2. 1 大鼠Morris 水迷宮結(jié)果術(shù)后4、8 w，SO 組和VD 組大鼠在定位航行試驗中的平均游泳速度均無明顯統(tǒng)計學差異( P ＞ 0. 05) 。術(shù)后4 w 和8 w，VD 組大鼠與同時間點SO 組大鼠平均逃避潛伏期比較均明顯延長( P ＜ 0. 001) ，提示VD 組大鼠在術(shù)后無明顯運動功能障礙，但存在空間學習能力減退，而且學習能力下降隨腦缺血時間延長加重。術(shù)后4 w 空間探索試驗中，SO 組和VD 組大鼠目標象限的平均搜尋時間比較具有統(tǒng)計學差異( P ＜ 0. 001) ，提示VD 組大鼠空間記憶能力下降。
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